Temporada primavera-verano 2020: la PCR

PCR. Nunca imaginé que estas siglas se iban a poner tan de moda. Pero lo que más me sorprende es la cantidad de “expertas/os” que abundan ahora mismo por las redes sociales y que parecen conocer perfectamente la técnica, especialmente para criticar la situación actual y dar a entender que no se está haciendo nada al respecto. Sin embargo, no voy a meterme en tema en este post. Os recomiendo leer este artículo que compartí hace unos días, que explica y desmiente varios bulos.

Este post está dedicado a la PCR en sí misma, técnica que realizo desde hace muchos años y que, actualmente, estoy llevando a cabo para la detección del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo grave (SARS-CoV-2) que provoca la enfermedad por coronavirus de 2019 (COVID-19).

Empecemos.    

¿Qué es la PCR?

Las siglas hacen referencia a la Polymerase Chain Reaction (reacción en cadena de la polimerasa). Se trata de una técnica de biología molecular que nos permite generar un gran número de copias de una secuencia específica de ácido desoxirribonucleico (ADN). ¿Recordáis cuando el/la profesor/a os castigaba escribiendo 100 veces la misma frase? Sería algo así, sólo que la frase estaría escrita usando, exclusivamente, 4 letras: A, T, C, G. Dichas letras hacen referencia a las bases nitrogenadas (adenina, timina, citosina y guanina, respectivamente), las cuales, unidas cada una a un grupo fosfato y a un azúcar (la desoxirribosa), forman los nucleótidos.

El ADN está formado por dos cadenas de nucleótidos complementarias entre sí: la A siempre se va a unir a una T y la C a una G. Estas dos cadenas se enrollan formando la espiral característica que habréis visto seguro en alguna ocasión. Dicha estructura puede compactarse aún más, dando lugar a los cromosomas. Estos serían como ovillos de lana, que si tirásemos de un extremo, los podríamos ir desenrollando hasta obtener un hilo muy largo (la cadena de ADN).

La PCR fue desarrollada por el Dr. Kary Mullis y su equipo a principios de los años 80, hecho que revolucionó la investigación biomédica de la época. El Dr. Mullis recibió, por ello, el Premio Nobel de Química en el año 1993. Os recomiendo que le echéis un vistazo a su biografía que no os dejará indiferentes. Fue un hombre bastante peculiar. Y aquí quiero hacer un inciso: esta técnica no hubiera podido ser creada sin el descubrimiento de la ADN polimerasa, la enzima responsable de la replicación del ADN, que es fundamental en la técnica de PCR. ¿Quiénes hicieron este gran descubrimiento? Tenemos que agradecer el gran trabajo de tres investigadores y sus equipos: Severo Ochoa, Arthur Kornberg y Margarita Salas. Como no es de extrañar, ambos doctores, pero no ella, recibieron el Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1959. Sin embargo, el trabajo de Margarita Salas fue la base de lo que hoy conocemos como biotecnología. Su perseverancia y esfuerzo dio como resultado el desarrollo de la biología molecular en España. Por ello: gracias Margarita.

Imaginemos ahora que el laboratorio es nuestra cocina y que vamos a llevar a cabo una receta. Por tanto, necesitaremos unos ingredientes, que se mezclarán en determinadas cantidades y que, posteriormente, se cocinarán a la temperatura y durante el tiempo necesario. ¿Qué ingredientes necesitamos para nuestra receta de PCR? Estos son:

• La cadena de ADN molde, es decir, el ADN que queremos amplificar (amplificación génica: aumento en el número de copias de un fragmento de ADN particular).
• La ADN polimerasa, la enzima que nos permite obtener copias de ADN a partir de ADN molde. La más utilizada es la Taq polimerasa, proveniente de la bacteria Thermus aquaticus.
• Cloruro de magnesio para el correcto funcionamiento de la polimerasa.
• Nucleótidos que se van a ir incorporando para generar las copias del ADN molde.
• Primers o cebadores que son pequeñas moléculas de ADN que nos van a delimitar exactamente el fragmento del ADN que queremos copiar.

Una vez tenemos los ingredientes preparados, es la hora de elaborar la receta. Y, como toda receta, tiene sus fases, sólo que en lugar de un horno o una sartén, utilizaremos un termociclador (aquí tenéis un ejemplo):

• Una fase de desnaturalización, en la que se eleva la temperatura a unos 94ºC para separar así las dos cadenas del ADN molde (recordad que la molécula de ADN está formada por dos cadenas, y lo que queremos es copiar una de ellas).
• Una fase de hibridación, en la que los primers/cebadores se unirán por complementariedad (la A con la T y la C con la G) a la cadena de ADN molde. La temperatura de esta fase oscila entre los 35 y los 60ºC.
• Una fase de elongación o extensión, en la que la ADN polimerasa va incorporando nucleótidos. La temperatura de esta fase depende de la enzima polimerasa empleada, pero suele ser de 72ºC.

Estas tres fases se repiten en torno a 35-40 veces (ciclos) y, tras ello, nuestra receta estaría lista. Pero…si el ADN es tan pequeño que no lo podemos ver a simple vista… ¿cómo sabremos que realmente se han hecho correctamente las copias del fragmento que nos interesa? 

Para ello, la forma tradicional de analizar los resultados (lo que llamamos “productos de la PCR”) es mediante una técnica llamada electroforesis. Esta técnica se fundamenta en una de las características del ADN: presenta carga negativa debido a los grupos fosfato. Si aplicamos un campo electromagnético, el/los fragmento/s amplificados se van a ir separando partiendo del polo negativo hacia el polo positivo.

Los productos de PCR (el resultado de nuestra receta) se colocan en un gel de agarosa conectado a una fuente de energía con polo negativo y polo positivo. Además, a los productos de PCR se les añade un elemento que emite una señal al ser estimulado por luz ultravioleta (UV). Tradicionalmente se ha usado el bromuro de etidio, pero, dado que presenta propiedades mutagénicas y, por tanto, ha de manejarse con determinadas normas de precaución y seguridad, se están utilizando otros elementos que no son potencialmente dañinos. Esto nos va a permitir ver dónde se encuentra nuestro producto de PCR en el gel de agarosa.

Añadimos, además, un marcador de peso molecular que nos permite identificar el tamaño y el peso molecular de nuestras muestras. Este marcador actúa, por tanto, como referencia con la que comparar nuestros fragmentos. Tras el proceso de migración, es decir, tras el proceso en el que los productos de PCR avanzan por el gel formando bandas atraídos por el polo positivo, se realiza una foto digital en exposición a la luz UV y un procesador de imagen se encarga de analizar las bandas.

Si nuestro fragmento de interés tiene 100 pares de bases (pb) de longitud, la banda que debemos observar ha de estar a la altura de la banda de 100 pb de nuestro marcador de tamaño. De esa forma podremos comprobar que, efectivamente, hemos amplificado el fragmento que queríamos. Para estar totalmente seguras/os de que es el fragmento correcto, el siguiente paso sería secuenciar la banda que observamos en el gel. Pero ya os hablaré sobre la secuenciación en otro momento.   

Desde el principio os he hablado de un ADN molde y, quizás, os estéis preguntando, ¿pero de dónde obtenemos el ADN? En el caso de los seres humanos puede ser, por ejemplo, a partir de sangre, de un tejido, o de la saliva, entre otros. Al proceso de obtener el ADN a partir de una muestra se le llama extracción. Y es una parte clave y fundamental para poder realizar posteriormente la PCR, o cualquier otra técnica de biología molecular que requiera ADN, de forma correcta.

Por tanto, tendremos una primera parte del proceso que es la extracción del material genético (comprar los ingredientes, conservarlos, y procesarlos antes de preparar la receta) y una segunda parte que corresponde, en este caso, a la PCR.

Centrémonos ahora en los virus. A partir de una muestra de una persona, como puede ser una muestra respiratoria como el exudado nasofaríngeo (el que principalmente se utiliza para la detección por PCR del SARS-CoV-2), y siguiendo todos los pasos anteriores, podremos saber si existe material genético del virus en cuestión en la muestra. Podremos determinar su presencia si observamos una banda en el gel de agarosa que se corresponda con el tamaño específico de la secuencia del virus que previamente hemos seleccionado. Sin embargo, hay dos cuestiones importantes con respecto al SARS-CoV-2:

– Si este virus es un virus de ácido ribonucleico (ARN) y no de ADN que es el molde que necesitamos para la PCR, ¿cómo es que se está utilizando esta técnica para detectar el virus?

– La PCR tradicional, que es la que se explica en este post, permite una detección cualitativa de un fragmento de interés (presencia/no presencia), pero… ¿se está usando esta PCR u otra variante para la detección del SARS-CoV-2?

Os dejo con estas preguntas en mente hasta la segunda parte del post, que estará disponible muy pronto. Si estáis interesadas/os, podéis indagar sobre el tema y, cualquier consulta, duda, sugerencia, será bienvenida. Además, incluiré un vídeo en el que llevaré a cabo una extracción casera de ADN que podréis realizar en casa (apto para niñas y niños). Las figuras las he realizado con Biorender, una herramienta muy interesante que os recomiendo. 

¡Espero que os haya resultado interesante!
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