TEMPORADA PRIMAVERA-VERANO 2020: LA PCR. Continuación

Aquí tenemos la segunda parte del post anterior. Antes de continuar, como os comenté, os dejo el vídeo que he grabado para que podáis realizar una extracción de ADN de forma sencilla en casa (yo la he hecho con tomate, pero podéis utilizar cualquier otra fruta o verdura).

 

Volvamos a nuestra receta de PCR y a las cuestiones que quedaron sin resolver. En primer lugar, os comenté que el material genético del SARS-CoV-2 es ARN (ácido ribonucleico) y no ADN (ácido desoxirribonucleico). Por tanto, la pregunta a resolver es: ¿cómo podemos realizar la PCR de este virus si no partimos de ADN? Antes de poder responder a esta cuestión, tenemos que aclarar algunos conceptos básicos de la biología molecular. Vamos allá.

La molécula de ADN codifica nuestra información genética, es decir, contiene la información que va a permitir que se formen elementos, como las proteínas, que tendrán sus funciones en el organismo. Pero esta información está encriptada y, para poder entenderla, es necesario traducirla. Como si de un libro se tratara. Para ello, deben ocurrir dos procesos: la transcripción y la traducción.

La transcripción es el proceso por el cual un fragmento de la cadena de ADN se copia a ARN (llamado ARN mensajero, porque contiene la información del ADN que va a convertirse en proteínas). Este fragmento, que va a estar localizado en una región específica del ADN y que va a dar lugar a un elemento funcional, es lo que denominados gen.

¿Y qué diferencias hay entre el ADN y el ARN? Por un lado, el ARN contiene como azúcar una ribosa, en lugar de una desoxirribosa. Por otro lado, las bases nitrogenadas no son exactamente las mismas que las del ADN. Concretamente, en lugar de tener timina (T), el ARN presenta uracilo (U). Por último, el ARN es una molécula mucho más inestable que el ADN, es decir, se degrada con mucha facilidad.

Ahora que conocemos un poco más la molécula de ARN, retomemos la transcripción. Este proceso es llevado a cabo por una enzima llamada ARN polimerasa. Aquí tenemos que nombrar de nuevo al Dr. Kornberg, cuyo trabajo estuvo muy enfocado sobre este tema. Una vez formada la molécula de ARN mensajero, que contiene la información valiosa para nuestras células, tiene lugar la traducción. Se van a ir uniendo de tres en tres los nucleótidos para dar lugar a los aminoácidos correspondientes que formarán las proteínas. Siguiendo las reglas del código genético, cada triplete de nucleótidos (codón) se va a corresponder con un aminoácido.

 

Todo esto que he desarrollado hace referencia a lo que ocurre en los organismos que presentan ADN como material genético en sus células, como los seres humanos. Sin embargo, algunos organismos, como ciertos virus, contienen ARN en lugar de ADN. Éste es el caso del SARS-Cov-2. Entonces, ¿es posible que se produzca el proceso inverso? Es decir, ¿es posible copiar a ADN una molécula de ARN?

En los años 70, dos investigadores, de forma independiente, describieron el papel de una enzima que denominaron transcriptasa inversa o retrotranscriptasa. Howard Temin y David Baltimore rompieron con el dogma central de la biología molecular al demostrar, en virus de la familia Retroviridae, que sí era posible el proceso inverso: crear, a partir de una molécula de ARN, una molécula de ADN denominado ADN complementario (más información sobre este descubrimiento aquí).

Pues sí, efectivamente, el proceso inverso puede ocurrir con la participación de esta enzima.  Por tanto, a la hora de realizar una PCR a partir del ARN de un virus, como puede ser el SARS-CoV-2, habrá que incluir una fase en el proceso: la retrotranscripción, utilizando para ello la enzima retrotranscriptasa.

Llegadas/os a este punto, os pregunto: ¿sería correcto extraer ADN de una muestra respiratoria humana para detectar la presencia del SARS-CoV-2 mediante PCR?… No, no sería correcto. En este caso, lo que vamos a extraer es ARN. Aunque el proceso es muy similar al de la extracción de ADN, es importante recordar que la molécula de ARN es muy “delicada”, de manera que la forma de trabajar con ella ha de ser más cuidadosa: hay que evitar a toda costa que el ARN se degrade. Y otra cosa también muy relevante: el ARN que vamos a extraer no sólo será del virus, sino también de nuestras propias células y de otros microorganismos que habiten en nuestro cuerpo. Entonces… ¿cómo vamos a diferenciar el ARN del SARS-CoV-2 del resto? ¿Cómo vamos a poder asegurarnos de si hay o no infección?

Todo esto nos lleva a la segunda cuestión que os planteé en el post anterior: la PCR que se está utilizando para detectar el SARS-CoV-2 en muestras respiratorias humanas es una variante  denominada PCR cuantitativa a tiempo real. Y para esta nueva receta se necesita un ingrediente muy especial: las sondas.

Respiremos, que ya estamos llegando a la parte más interesante. Primero, la PCR cuantitativa a tiempo real, como su nombre indica, nos permite detectar y medir la cantidad de copias del ADN retrotranscrito (producido gracias a la adición de la enzima ARN polimerasa) que se van generando. Esto es posible porque vamos a añadir el ingrediente especial: las sondas. Éstas son secuencias específicas, en este caso, de regiones del ARN del SARS-CoV-2 y que, por tanto, se unirán sólo en el caso de que el virus esté presente en la muestra. Estas sondas estarán marcadas mediante fluorescencia, de forma que cuanta mayor cantidad de copias del ADN complementario del virus haya en la muestra, mayor fluorescencia vamos a observar. Si no hay virus, no vamos a ver esta fluorescencia y podremos decir que el resultado es negativo.    

Por tanto, los equipos de PCR a tiempo real están formados por distintos elementos:

• Un termobloque (bloque que va a alcanzar diferentes temperaturas) que permite la amplificación de las muestras.
• Una fuente de luz con diferentes filtros que permiten excitar las sondas.
• Un sistema detector que recoge la fluorescencia emitida y la transforma en señales eléctricas que son pasadas a un ordenador. En éste, a través del software adecuado, los resultados de la amplificación se pueden observar en tiempo real. En el punto 5 de la siguiente imagen podéis observar una muestra positiva y otra negativa.

 

Imprescindible trabajar en condiciones de seguridad máxima para realizar esta técnica en el caso de los virus. No sólo con equipos de protección individual, si no en laboratorios adaptados y con las herramientas necesarias. No en todos los laboratorios se pueden realizar estas pruebas. El problema no es la falta de “ingredientes” para realizar la receta. El problema es la falta de “cocinas” especiales de alto nivel de seguridad para llevarla a cabo.

No voy a entrar a describir en detalle el proceso concreto y cómo funciona la reacción. Si alguien está muy interesada/o, os dejo algunos artículos al respecto. Donde sí voy a entrar es en otro tema que, considero, es mucho más importante. Si revisáis los párrafos anteriores de este post, habréis leído que las sondas se diseñan de manera que se unen específicamente a secuencias del virus. Para que esto sea posible, primero, algún grupo de personas tiene que haberse dedicado a secuenciar el genoma del virus en cuestión. Si este grupo de persona no hubiera dedicado años y esfuerzo a estudiar estos virus, ahora no podríamos realizar una PCR específica del SARS-CoV-2 (ni de otros virus no menos importantes).

Me gustaría que reflexionarais sobre esto. Sobre el papel que tiene la investigación, en este caso básica, la del conocimiento por el conocimiento, en el avance de la sociedad. Éste es un claro ejemplo de cómo la investigación, que requiere tiempo, paciencia y, por supuesto, financiación, acaba teniendo sus frutos y se aplica directamente a la práctica clínica.

Posiblemente, hasta ahora, a mucha gente no le importaba para nada si diferentes grupos de investigadoras/es se dedicaban en cuerpo y alma al estudio de un bichito minúsculo que ni se sabe con certeza si es un ser vivo o no. Pero ahora sí importa. Y aun así, sigo sin creer que todo el mundo sea consciente de la importancia que tiene todo esto. La ciencia nos va a salvar la vida, así de simple.

Resumiendo, si conocemos la secuencia de un virus, podremos crear nuestro ingrediente especial, las sondas, que nos permitirán detectarlo y dar un diagnóstico. Si conocemos qué estructura tiene, cómo actúa, cómo entra en nuestras células, etc., etc., podremos desarrollar tratamientos y vacunas y podremos averiguar cómo responde nuestro sistema inmunitario.

Así que repito: la ciencia nos va a salvar la vida. Como en muchísimas otras ocasiones a lo largo de la historia. Que no se nos olvide.

 

Más información sobre la PCR cuantitativa a tiempo real:

• Bustin SA, Nolan T. RT-qPCR Testing of SARS-CoV-2: A Primer. Int J Mol Sci. 2020;21(8):E3004. Published 2020 Apr 24. doi:10.3390/ijms21083004 (https://www.mdpi.com/1422-0067/21/8/3004/htm)

• http://www.biorad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf